เมื่อปี พ.ศ.2508 ป่าไม้เขตบ้านโป่งขอให้กรมป่าไม้ประกาศห้ามการล่าสัตว์ป่าในบริเวณป่าทุ่งใหญ่ เนื่องจากเห็นว่ามีสัตว์ป่าอาศัยอยู่อย่างชุกชุมและมีคนเข้าไปล่าสัตว์ป่ากันมาก กองบำรุง กรมป่าไม้ ซึ่งรับผิดชอบงานด้านการสงวนและคุ้มครองสัตว์ในขณะนั้น จึงได้ส่งเจ้าหน้าที่ไปสำรวจและตรวจสอบในปี พ.ศ.2510 และเห็นว่ามีความเหมาะสมที่จะจัดตั้งเป็นเขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่า
แต่เนื่องจากพื้นที่มีขนาดใหญ่ยังมีประทานบัตรและการอนุญาตทำประโยชน์อื่นๆ อีกหลายอย่างในป่าแห่งนี้ จึงได้มีหนังสือขอความร่วมมือจากจังหวัดกาญจนบุรีและจังหวัดตาก ระงับใบอนุญาตใดใดที่กระทบกระเทือนต่อแผนการจัดตั้งเป็นเขตรักษาพันธุ์สัตว์ และได้ส่งเจ้าหน้าที่ออกไปดำเนินการเตรียมการจัดตั้งเขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าตั้งแต่เดือนมกราคม พ.ศ. 2516
ต่อมาได้ปรากฏข่าวอื้อฉาวทางหน้าหนังสือพิมพ์ว่า เครื่องบินเฮลิคอปเตอร์ของทางราชการเครื่องหนึ่งเกิดอุบัติเหตุตกพังพินาศที่อำเภอบางเลน จังหวัดนครปฐม เมื่อวันที่ 29 เมษายน พ.ศ.2516 มีผู้เสียชีวิต 6 คน และพบซากสัตว์ป่าปะปนอยู่กับซากปรักหักพังของเฮลิคอปเตอร์ ซึ่งกลายเป็นเรื่องที่เกี่ยวโยงไปถึงกรณีที่สื่อมวลชนและนิสิตนักศึกษากลุ่มอนุรักษ์ธรรมชาติได้ไปพบคณะล่าสัตว์ในป่าทุ่งใหญ่ ทำการล่าสัตว์โดยไม่เกรงกลัวต่อเจ้าหน้าที่ และยืนยันว่าเป็นคณะเดียวกันกับคณะเฮลิคอปเตอร์ตก ทำให้กรณีทุ่งใหญ่เป็นข่าวใหญ่และเป็นที่สนใจของคนทั่วไปอยู่เป็นเวลานาน
คณะกรรมการสงวนและคุ้มครองสัตว์ป่า ได้มีการประชุมเมื่อวันที่ 13 มิถุนายน พ.ศ.2516 และมีมติให้ดำเนินการประกาศป่าทุ่งใหญ่เป็นเขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่า โดยให้ชื่อว่า เขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าทุ่งใหญ่นเรศวร เพื่อเป็นการเทิดพระเกียรติสมเด็จพระนเรศวรมหาราชที่เคยหยุดทัพในบริเวณทุ่งใหญ่ระหว่างการยกทัพไปรบกับพม่า และได้ดำเนินการต่อไปตามขั้นตอนจนเป็นเขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่า ประกาศในราชกิจจานุเบกษาฉบับพิเศษ เล่ม 91 ตอนที่ 72 ลงวันที่ 24 เมษายน พ.ศ.2517 ปัจจุบันได้รับการขึ้นทะเบียนร่วมกับเขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าห้วยขาแข้งให้เป็นมรดกทางธรรมชาติของโลกเมื่อพ.ศ. 2534
เขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าทุ่งใหญ่นเรศวร ตั้งอยู่ในท้องที่ตำบลไล่โว่ อำเภอสังขละบุรี จังหวัดกาญจนบุรี และตำบลแม่ละมุ้ง อำเภออุ้มผาง จังหวัดตาก มีเนื้อที่ทั้งหมดประมาณ 33,647.2 ตารางกิโลเมตร หรือ 2,279,500 ไร่
สัตว์ป่าสงวนที่สำคัญ
เขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าทุ่งใหญ่นเรศวรด้านตะวันออก