ชาวโปรตุเกสเป็นชาวยุโรปชาติแรกที่เข้ามาติดต่อค้าขายกับกรุงศรีอยุธยา โดยปีพ.ศ. 2054 ได้ส่งนายดูอาร์เต้ เฟอร์นันเดส เป็นฑูตเข้ามาเจริญสัมพันธไมตรีกับสมเด็จพระรามาธิบดีที่ 2 แห่งกรุงศรีอยุธยา ต่อมาชาวโปรตุเกสเข้ามาตั้งหลักแหล่งค้าขายกันมากขึ้นจนต้องจัดตั้งเป็นหมู่บ้าน ชาวโปรตุเกสได้รับพระบรมราชานุญาตให้ตั้งหมู่บ้านขึ้นริมฝั่งแม่น้ำเจ้าพระยาฝั่งตะวันตกทางด้านใต้ของเกาะเมืองและได้รับราชการเป็นทหารอาสา โดยได้นำอาวุธปืนพร้อมยุทธวิธีการรบแบบใหม่เข้ามาฝึกอบรมให้กับกองทัพไทย
นอกจากนั้น ยังได้รับพระบรมราชานุญาตให้ทำการค้าและเผยแพร่คริสต์ศาสนาได้อย่างเสรีทั้งในอยุธยาและหัวเมืองต่างๆ ได้มีการสร้างโบสถ์ในคริสต์ศาสนาไว้ถึง 3 แห่ง คือ คณะโดมินิกัน คณะเยซุอิต และคณะฟรังซิสกัน และได้มีการแต่งงานกับชาวไทย และชาวต่างชาติอื่น ๆ
หมู่บ้านโปรตุเกสตั้งอยู่ริมแม่น้ำเจ้าพระยาฝั่งตะวันตกอยู่ในเขตตำบลสำเภาล่ม อำเภอพระนครศรีอยุธยา จังหวัดพระนครศรีอยุธยา ห่างจากเกาะเมืองไปทางทิศใต้ราว 4 กิโลเมตร ลักษณะแผนผังหมู่บ้านยาวจากด้านทิศเหนือไปทางด้านทิศใต้ประมาณ 2 กิโลเมตร ส่วนกว้างจากด้านตะวันออกไปทางด้านตะวันตกประมาณ 200 เมตร ตัวหมู่บ้านโปรตุเกสมีลักษณะเป็นเกาะล้อมรอบด้วยคูน้ำ 3 ด้าน คือด้านทิศเหนือ ทิศตะวันตกและทิศใต้ ส่วนทางด้านทิศตะวันออกติดริมฝั่งแม่น้ำเจ้าพระยา ปัจจุบันยังคงเห็นร่องรอยคูน้ำอยู่ทั้ง 3 ด้าน
ภายในจัดแสดงประวัติความเป็นมาของชาวโปรตุเกสในสมัยอยุธยา และหลุมฝังศพชาวโปรตุเกส
-บ้านโปรตุเกส (ชุมชนสมัยอยุธยา)
-ศึกษาประวัติศาสตร์ชุมชนชาวโปรตุเกสสมัยอยุธยา
-สิ่งปลูกสร้างโบราณร่องรอยทางประวัติศาสตร์
-หลุมฝังศพชาวโปรตุเกส
-โครงกระดูกชาวโปรตุเกส